Estudio genético del carcinoma colorrectal esporádico y familiar en Colombia
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ESTUDIO GENÉTICO DEL CARCINOMA COLORRECTAL ESPORÁDICO Y FAMILIAR EN COLOMBIA.pdf
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Resumen en español
Introducción En este trabajo, se planteó describir las principales características clínicopatologicas y algunos de los fenotipos moleculares de Carcinoma Colorrectal (CCR), enfermedad que presenta altas tasas de incidencia y mortalidad en Colombia. Métodos Se analizaron dos grupos en una muestra de 1278 pacientes a saber: 1) CCR esporádico y 2) CCR con agregación familiar. En el primer grupo, se evaluaron por PCR convencional los genes APC, KRAS y TP53 y, utilizando “Next generation sequencing” (NGS), además de los anteriores, se estudiaron otros 47 genes involucrados con la predisposición a desarrollar cáncer. En el segundo grupo, se analizaron variantes de los genes MMR, MUTYH y APC y otros genes involucrados en síndromes hereditarios como: STK11, PTEN, POLE, SMAD4 y CDH1. Para los análisis de expresión de los genes MMR (Mismatch Repair) hMLH1, se utilizaron métodos inmunohistoquímicos (IHC), usando ADN de tejido tumoral incluido en parafina, para buscar mutaciones somáticas por PCR convencional y NGS con la metodología Ion Torrent. En los casos de CCR con agregación familiar, se aplicaron criterios clínicos, se tomo una muestra de sangre por venopunción periférica, a partir del ADN se crearon librerias genicas, mediante PCR microfluídica de fluidigm y, posteriormente, se secuenciació por Illumina Miseq, las variantes candidatas resultantes se secuenciaron por (sanger); el análisis de inestabilidad microsatelital se realizó por PCR-FCE (fluorescent capillary electrophoresis) usando el panel de Bethesda.Resultados Los resultados muestran que el promedio de edad de los pacientes colombianos con CCR es de 57,4 años, aproximadamente 10 años menor que en los países desarrollados; la enfermedad es más frecuente en el género femenino 53,2%. La frecuencia de los pacientes menores de 50 años (26,5%), es mayor a la esperada, el CCR, en estos casos se asoció a los tipos histológicos agresivos -carcinoma mucinoso y carcinoma en anillo de sello- p=<0.000, los cuales, a su vez, resultaron asociados a inestabilidad microsatelital (MSI-H). La localización más frecuente fue en el recto (31,1%), p=0,002 y el diagnóstico se produjo en estados avanzados de la enfermedad T3-T4 (75,1%) p=0,022. El tipo histológico más frecuente es el adenocarcinoma. La sensibilidad del análisis inmunohistoquímico de MLH1 para la detección de MSI+, fue de 71% (CI: 49 - 87). El análisis por IHC-MLH1 en 575 casos mostró pérdida de la expresión en el 7% de los pacientes. Las pruebas de MSI (inestabilidad microsatelital) se realizaron en 451 casos de CCR; el 23% presentaron alta inestabilidad microsatelital (MSI-H). El panel molecular para genes conocidos, relacionados con CCR esporádico, que esperamos se convierta en una herramienta para el desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas, revela hasta el momento -además de algunas variantes nuevas con potencial patogénico, en fase de validación-, los siguientes porcentajes de mutaciones: KRAS 23,9%, TP53 63,4% y APC 40,3%. Las variantes más frecuentemente encontradas por tipo de gen son: TP53 R175H (26%), KRAS G12D (11%), APC K1363N (14%); el 25% de los pacientes son triple negativos para las mutaciones en estos genes lo que obliga a investigar otras rutas en la carcinogénesis del CCR. El 66% de las mutaciones encontradas por el método NGS resultaron ser no sinónimas, el gen con mayor frecuencia de mutaciones patogénicas por NGS fue el APC (12%).En el grupo de personas con síndromes de CCR con agregación familiar, se muestrearon 459 pacientes, 74% de ellos fenotípicamente sanas, 72% menores de 50 años; se identificaron 48 mutaciones en genes conocidos, de las cuales 18 tienen implicaciones funcionales. El síndrome familiar más frecuente es el de Lynch 85%, con tres mutaciones no sinónimas en MSH2, de las cuales dos se presentaron en más de una familia -MSH2 c.G1034A y MSH2 c.1552C>T, en dos y tres individuos respectivamente, estas variantes fueron reportadas previamente en Europa, pero no se encontraron reportes para Colombia- la tercera es una variante nueva -c.2458+1G>T con potencial patogénico, en evaluación-. Para MLH1, se encontraron la mutación c.C445T, sin reportes conocidos en Colombia y, una variante nueva c.545+1G>C con potencial patogénico, en evaluación. Adicionalmente, en este trabajo se presentan los primeros reportes para Colombia de poliposis asociada a las variantes SMAD4 c.403C>T y MUTYH c.1437_1439delGGA. El 80% del total de las familias corresponde a casos de CCR familiar no sindrómico, generalmente clasificados como like Linch y poliposicos, en los que no se encontraron mutaciones en genes conocidos de alto riesgo para síndromes familiares, por lo tanto, se genera la necesidad de implementar nuevas dianas moleculares para determinar un perfil genético de esos pacientes, que permita establecer el riesgo de padecer la enfermedad. Conclusiones El CCR en Colombia se presenta en promedio 10 años antes comparado con los países desarrollados. Es necesario establecer políticas públicas de tamizaje para CCR en la población menor de 50 años, realizar el tamizaje con Inmunohistoquimica para MLH1 y la determinación de inestabilidad microsatelital, que permiten identificar pacientes en riesgo de ser portadores de mutaciones relacionadas con síndrome de Lynch. La identificación de variantes génicas nuevas y de las mutaciones con primer reporte para Colombia, en genes relacionados con cáncer familiar, permitirá, establecer estrategias preventivas para el tamizaje de dichas mutaciones en la población en riesgo.
Resumen en español
Introduction The purpose of this paper was to describe the main clinicopathological features and some of the molecular phenotypes of Colorectal Carcinoma (CRC), a disease with high rates of incidence and mortality in Colombia. Methods: In a sample of 1278 patients, two groups were analyzed: 1) sporadic CRC and 2) CRC with familial aggregation. In the first group, the APC, KRAS and TP53 genes were evaluated by conventional PCR and “Next Generation Sequencing” (NGS). Besides these genes, other 47 genes involved with the predisposition to develop cancer were studied, including variants of the genes MMR, MUTYH and APC and other genes involved in hereditary syndromes such as STK11, PTEN, POLE, SMAD4 and CDH1. Analysis of expression of the MMR (Mismatch Repair) hMLH1 gene was done with immunohistochemical methods (IHC), using DNA tumor tissue embedded in paraffin to evaluate for somatic mutations using conventional PCR and NGS with Ion Torrent. In cases of CRC with familial aggregation, clinical criteria were applied: a blood sample was taken by peripheral venipuncture; DNA genome libraries were created using PCR microfluidics of Fluidigm and sequencing with Illumina Miseq and the resulting candidate variants were sequenced using Sanger method. The microsatellite instability analysis was performed using PCR-FCE (Fluorescent capillary electrophoresis) using the Bethesda panel. Results Our research indicates that the average age of Colombian CRC patients is 57.4 years (approximately 10 years younger than in developed countries). The disease is more common in females (53.2%). The frequency of patients younger than 50 years (26.5%) is higher than expected; the CCR in these cases was associated with histological types: agressive, mucinous carcinoma and singlet ring carcinoma (P= <0.000), which in turn were associated with microsatellite instability (MSI-H). The most frequent location was in the rectum (31.3%), p=0.002 and the diagnosis occurred in advanced stages of the disease T3-T4 (75.1%) p=0.022. The most common histological type was adenocarcinoma. The sensitivity of the immunohistochemical analysis of MLH1 for the detection of MSI+ was 71% (Cl: 49-87). In 575 cases, the IHC-MLH1 analysis showed loss of expression in 7% of patients. MSI analysis (microsatellite instability) was performed in 451 cases of CRC, with 25% showinghigh microstatellite instability (MSI-H). The molecular panel for known genes related to sporadic CRC could become a tool for the development of new diagnostic therapeutic strategies. This panel reveals some new variants with pathogenic potential during the validation phase with the following percentage of mutations: KRAS 23.9%, TP53 63.4% and APC 40.3%. The most frequent variants encountered by gene type were: TP53 R175H (26%), KRAS G12D (11%) and APC K1363N (14%). Approximately 25% of patients were triple negative for mutations in these genes, leading to the investigation of other routes of carcinogenesis in CRC. Non synonymous mutations were found in 66% of the mutations discovered by the the NGS method and the gene with more frequency of pathogentic mutations found by this method was APC (12%). In the group of people with CRC syndrome with familial aggregation, 459 patients were sampled, with 74% of them being phenotypically healthy and 75% younger than 50 years old. A total of 48 mutations in known genes were identified, of which 18 have functional implications. The most frequent familial syndrome was Lynch syndrome (85%) with three nonsynonymous mutations in MSH2; two of which were presented in more than one family (MSH2 c.G1034A and MSH2 c.1552C>T in two and three individuals respectively). These variants were previously reported in Europe, but no reports were found in Colombia. The third one is a new variant –c.2458+1G>T with pathogenic potential in evaluation. Additionally, this paper presents the first reports known in Colombia of polyposis associated with variants SMAD4 c.403C>T and MUTYH c.1437_1439delGGA. Familial, non syndromic cases of CRC were found in 80% of the families evaluated and were generally classified as Lynch and polyposis, in which mutations in known genes of high risk for familial syndromes were not found. Therefore, there is a need to implement new molecular targets to determine the genetic profile of those patients, in order to establish the risk of disease. Conclusions. The CRC in Cololombia occurs on average 10 years earlier compared to developed countries. It is necessary to establish public policies for CRC screening in the population younger than 50 years old. These screenings should be done with immunohistochemistry for MLH1 and microsatellite instability to identify patients at risk of being carriers of mutations related to Lynch syndrome. The identification of new gene variants and the mutations reported for the first time in Colombia in familial cancer-related genes will allow the establishment of preventive screening for such mutations in the population at risk. Keywords: Colorectal cancer, genetic syndromes with familial aggregation mutations
