AGA. Tesis y Trabajos de Grado
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- PublicaciónAcceso abiertoAlmidones de arroz nativos y modificados como materiales de encapsulamiento y liberación controlada de principios naturales de origen vegetal(Universidad del Tolima, 2021) Montoya Yepes, Diego FernandoIntroducción: La encapsulación de compuestos activos es una tecnología ampliamente utilizada para la administración de fármacos dado que protege los activos contra la degradación por factores ambientales y fisiológicos. Los almidones modificados han cobrado relevancia por sus propiedades, especialmente, si se sintetizan mediante metodologías respetuosas con el medio ambiente. Por lo anterior y buscando impactar las cadenas de producción del departamento del Tolima y el avance en la generación de posibles fitoterapéuticos, nuestro objetivo fue evaluar el almidón de arroz acilado enzimáticamente, como material para la encapsulación de fracciones ricas en polifenoles obtenidas de Gulupa. Metodología: Se modificó almidón de arroz de la variedad F60 empleando la lipasa CAL-B y ácidos grasos libres en un sistema con solvente (M1) y Aceite de Gulupa en un sistema libre de solvente (M2). El polímero fue caracterizado fisicoquímicamente; este se usó como material de pared para el atrapamiento de sustancias activas. Se encapsuló la fracción de acetato de etilo (rica en polifenoles) obtenida de las semillas de Gulupa. Se evaluaron dos metodologías de atrapamiento (Emulsión y Aspersión). A las cápsulas se les caracterizó la eficacia de atrapamiento, tamaño, potencial z, se evaluó la cinética de liberación de compuestos con actividad antioxidante y su estabilidad luego de 8 meses. Los resultados se analizaron utilizando el software Statgraphic Centurión XVI, cada ensayo tuvo un n = 3, los resultados se expresaron como la media ± desviación estándar. Resultados: En los sistemas de modificación se lograron rendimientos superiores al 77%. Morfológicamente el gránulo no logra homogeneidad en M1, en cuanto a M2 se logra una morfología homogénea. Los contenidos de amilosa sólo disminuyen en M1. En las propiedades funcionales hay variación en la solubilidad en agua y aceite, siendo M2 el más soluble en solventes apolares, además de presentar una menor degradabilidad, esto sumado a las condiciones de modificación, llevaron a seleccionar este polímero para evaluarlo como material de pared. Se observaron porcentajes de atrapamiento de fenoles superiores al 40% y 90% en encapsulación por emulsión y aspersión respectivamente, obteniendo cápsulas con potencial zeta, tamaño y características morfológicas reportadas en administración oral. Los sistemas tienen parámetros de liberación en respuesta al pH básico, mostrando un comportamiento diferencial del material, dependiendo del tipo de compuestos fenólicos presente en la fracción. Se mantiene la actividad antioxidante de los compuestos activos, mostrando un aumento en la actividad con el aumento en la concentración de los compuestos liberados, garantizando la estabilidad de los compuestos en 8 meses de almacenamiento, destacando los encapsulados por aspersión ya que permiten una mayor cantidad de fenoles concentrados, y una mayor actividad biológica. Conclusión: El Almidón de arroz modificado con aceite de gulupa se obtuvo en condiciones ecológicas y presenta la capacidad de atrapar polifenoles por emulsión y aspersión, generando cápsulas con características reportadas para uso en administración oral, además presenta parámetros de liberación en respuesta al pH. Los procesos de encapsulación y el almidón modificado utilizado como material de pared no interfieren con la actividad biológica, asegurando su estabilidad durante 8 meses de almacenamiento.
- PublicaciónRestringidoFactores líticos innatos de los vectores del grupo Prolixus contra genotipos de Trypanosoma rangeli y DTUs de Trypanosoma cruzi(Ibagué : Universidad del Tolima, 2019, 2019) Suárez Quevedo, YazmínHasta la fecha se han descrito cinco genotipos de Trypanosoma rangeli denominados A, B, C, D y E. Por otro lado, se han sido descrito 21 especies del género Rhodnius, consideradas como los vectores biológicos de este parásito. Las especies de Rhodnius conforman tres grupos filogenéticos, el grupo Pallescens al occidente de la cordillera de los Andes y los grupos Pictipes y Prolixus al oriente de esta cordillera. Algunos genotipos de T. rangeli, no logran sobrevivir a la respuesta inmune de algunas especies de Rhodnius y no consiguen producir formas infectivas en las glándulas salivares. Cuando T. rangeli ingresa al intestino del vector, debe enfrentar diversas enzimas digestivas, hemolisinas, aglutininas, factores derivados de la microbiota intestinal, péptidos antimicrobianos y factores líticos. Posteriormente, cuando el parásito atraviesa la pared intestinal del vector, se enfrenta en la hemolinfa con péptidos animicrobianos, activación del sistema profenol oxidasa, fagocitosis, producción de superóxido y óxido nítrico. En este trabajo se examinó la inmunidad innata en el contenido intestinal y la hemolinfa de siete especies de vectores contra los cinco genotipos de T. rangeli, encontrando que en el intestino anterior y en la hemolinfa de dos especies del grupo Prolixus (R. prolixus, R. robustus) se detectaron factores líticos innatos, de naturaleza proteica, contra T. rangeli C y T. rangeli E. La inoculación de los genotipos C y E en el hemocele de R. prolixus también mostró lisis de los parásitos. Los genotipos A, B y D de T. rangeli presentaron resistencia a la lisis. En las especies del grupo Pallescens (R. pallescens, R. colombiens y R. ecuadoriensis), en R. pictipes, Triatoma maculata y Panstrongylus geniculatus no se detectaron factores líticos en los mismos tejidos de los insectos contra ningún genotipo de T. rangeli. En Trypanosoma cruzi se han reportado seis unidades taxonómicas discretas (DTUs), denominadas T. cruzi I, II, III, IV, V y VI; adicionalmente se han descrito T. cruzi bat y T. cruzi marinkellei. La caracterización molecular de las cepas de T. cruzi aisladas de cinco géneros de triatominos vectores, muestra que en algunas regiones geográficas de Latinoamérica existe predominio de algunas DTUs del parásito sobre otras, indicando que el vector podría ser responsable de esta distribución geográfica variable de las DTUs. Cuando T. cruzi ingresa al intestino del vector, debe enfrentar diversas enzimas digestivas, hemolisinas, aglutininas, factores derivados de la microbiota intestinal, péptidos antimicrobianos, activación del sistema profenol oxidasa, producción de superóxido, y producción de óxido nítrico. En este trabajo, se detectaron factores líticos innatos en el intestino anterior de R. prolixus y R. robustus contra T. cruzi II y en la hemolinfa de los mismos vectores, se detectó actividad lítica contra T. cruzi II, III, V, VI, T. cruzi bat y T. cruzi marinkellei. Adicionalmente fue posible comprobar que estos factores innatos, de naturaleza proteica, contra T. rangeli o contra T. cruzi, son independientes de la fuente de alimento (mamífero o ave) e independientes de los factores del complemento de las aves o de los mamíferos. También se comprobó que la actividad lítica fue independiente del tiempo de mantenimiento de los parásitos en medios de cultivo y que los resultados fueron idénticos con vectores recién capturados en el campo y con aquellos mantenidos en colonias de laboratorio durante varios años. En ninguna de las restantes especies estudiadas, R. pallescens, R. colombiensis, R. ecuadoriensis, R. pictipes, T. maculata y P. geniculatus, se detectaron factores líticos contra las diferentes DTUs de T. cruzi. En el contenido del intestino anterior y en la hemolinfa de R. prolixus (especie con actividad tripanolítica), se identificaron 28 y 103 proteínas respectivamente, mediante análisis de espectrometría de masas en tándem acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (LC-MS/MS). En el contenido del intestino anterior y en la hemolinfa de R. colombiensis (especie sin actividad tripanolítica) se identificaron 17 y 85 proteínas respectivamente. De las proteínas identificadas, 43 se relacionaron con respuesta inmune, tales como reconocimiento de carbohidratos y lípidos, activación y regulación de cascadas proteolíticas, proteínas relacionadas con estrés oxidativo, péptidos antimicrobianos y proteínas relacionadas con el sistema del complemento. El análisis de presencia/ausencia de estas proteínas en las dos especies de vectores, mostró que en el intestino anterior de R. prolixus, se detectaron las nitroforinas 1, 2, 4A y en la hemolinfa las nitroforinas 1, 4, 4A, los péptidos antimicrobianos defensina y prolixina. Estas proteínas no fueron detectadas en el intestino anterior y en la hemolinfa de R. colombiensis. Debido a que las nitroforinas son moléculas transportadoras de óxido nítrico, su presencia en la saliva que ingresa al intestino anterior durante la toma del alimento, podría ser responsable de la liberación del óxido nítrico, el cual es tóxico para el parásito y podría responder por la lisis observada. En la hemolinfa, las nitroforinas detectadas, la defensina y la prolixina, podrían estar asocadas con la actividad lítica encontrada. Nuevos estudios sobre estas moléculas permitirán reconocer sus mecanismos de acción sobre T. rangeli y T. cruzi. El hallazgo inédito de las nitroforinas como factores antiparasitarios, y probablemente de algunos péptidos antimicrobianos, se reporta por primera vez en el intestino anterior y en la hemolinfa de R. prolixus, representante del grupo Prolixus, pero ausente en R. colombiensis, representante del grupo Pallescens. Estos hallazgos soportan la hipótesis propuesta en este trabajo, sobre el papel de las especies del grupo Prolixus, en las cuales estos factores antiparasitarios de inmunidad innata, estarían sobreexpresados y podrían responder por la escasa o nula circulación de T. cruzi II, V, VI, T. cruzi bat, T. cruzi marinkellei, T. rangeli C y E en los vectores del grupo Prolixus en algunas regiones de Latinoamérica. Nuevos trabajos con otras especies de vectores de los grupos Prolixus y Pictipes, permitirán obtener información para fortalecer la hipótesis aquí propuesta. Palabras clave: Trypanosoma cruzi, T. rangeli, transmisión selectiva, grupo Prolixus, enfermedad de Chagas, Rhodnius prolixus, R. robustus, intestino anterior, hemolinfa, nitroforinas, péptidos antimicrobiales
- PublicaciónRestringidoPotencial antioxidante y modulador de la inflamación de Mollinedia Racemosa, Siparuna Sessiliflora y Croton Leptostachyus(Ibagué : Universidad del Tolima, 2018, 2018) Sánchez Peralta, Wilmer FernandoEl objetivo del presente trabajo fue evaluar el potencial antioxidante y antiinflamatorio de Mollinedia racemosa, Siparuna sessiliflora y Croton leptostachyus; especies pertenecientes a géneros usados en el tratamiento de dolencias asociadas al dolor e inflamación y que se caracterizan por ser ricas en metabolitos secundarios como fenoles y terpenoides principalmente. Las hojas de cada una de las especies, fueron secadas a temperatura ambiente durante un periodo de 24-48 horas; posteriormente se colocaron en contacto con el solvente por 48 horas. Los extractos etanólicos obtenidos fueron concentrados hasta sequedad mediante rotaevaporación a temperatura inferior a 50o C, se prepararon subextractos a partir de los extractos secos mediante partición líquido/sólido con n-hexano, acetato de etilo y etanol para así establecer un perfil de polaridad. La actividad antirradical de los subextractos de cada una de las plantas se midió in vitro mediante ensayos de estabilización de las especies DPPH, ABTS así como mediante la inhibición del óxido nítrico. El efecto modulador de la inflamación fue medido in vivo en ratones ICR mediante ensayos de fase aguda (edema auricular inducido por TPA) y subcrónica (modelo de bolsa de aire tratada con zimosano); las matrices biológicas obtenidas en cada uno de los modelos fueron sometidas a extracción proteica con el fin de evaluar parámetros marcadores de respuesta inflamatoria tales como: Mieloperoxidasa (MPO) y las citoquinas Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 10 (IL-10). Así mismo, se realizó un análisis fitoquímico con el fin de reconocer las principales metabolitos secundarios presentes en las especies y posteriormente, teniendo en cuenta las fracciones con mayor poder antiinflamatorio, se hizo análisis por UHPLC con el fin de poder identificar compuestos fenólicos que pudieran estar asociadas al efecto antiinflamatorio y antioxidante observado. Los resultados obtenidos en las pruebas de actividad antirradical mostraron un patrón de respuesta que parece guardar relación directa con el contenido fenólico y con el solvente extractor. De este modo, la especie con mayor capacidad antioxidante en todos los ensayos fue Mollinedia racemosa (EtOHMr), seguida de Croton leptostachyus (AcOEtCl) y por último de Siparuna sessiliflora (EtOHSs). Los resultados del modelo in vivo de edema auricular, mostraron un marcado efecto antiinflamatorio en los subextractos de acetato de etilo de las especies estudiadas en comparación con las matrices etanólicas y hexánicas. La muestra más activa luego del patrón de indometacina (85.69% de inhibición) fue AcOEtCl (67.53%) seguida por AcOEtSs (46.46%) y AcOEtMr (43.46%). C. leptostachyus mostró un destacable efecto inhibitorio de la MPO (mieloperoxidasa) producida en el modelo de bolsa de aire (17.16% y 63.28% a dosis de 10 mg/kg y 50 mg/kg respectivamente). En el caso de F2AcOEtSs, esta especie no parece mostrar efecto inhibitorio de esta enzima. En el análisis de TNF-α algunos tratamientos mostraron un efecto muy cercano al de la indometacina (64.49%): de este modo, son destacables F2AcOEtSs (50 mg/Kg, 57.92%), F3AcOEtMr a (10 mg/kg (59.75%) y 50 mg/kg (57.19)). El análisis fitoquímico mostró variedad compuestos que incluye terpenoides, alcaloides y metabolitos fenólicos (taninos, flavonoides y fenilpropanoides). Estos últimos fueron corroborados mediante UHPLC. Toda la información recopilada perfila a dos subextractos como los más promisorios en función de las capacidades antirradicalaria (EtOHMr) y anti-inflamatoria (AcOEtCl) que se sustenta en el contenido fitoquímico y antecedentes etnobotánicos de los géneros a los que pertenecen. A partir de lo anterior, se puede inferir que las especies estudiadas tienen potencial farmacológico en el ámbito de las terapias antiinflamatorias alternativas, debido a la 22 variedad de su composición química y a su capacidad quimiopreventiva que guarda relación con el método de extracción empleado. Palabras Claves: Mollinedia racemosa, Siparuna sessiliflora, Croton leptostachyus, actividad antiinflamatoria, actividad antioxidante
- PublicaciónAcceso abiertoAnálisis genético del cáncer colorrectal en poblaciones mestizas de Colombia(Ibagué : Universidad del Tolima, 2017, 2017) Criollo Rayo, Ángel AlexandroLa mayoría de los marcadores de susceptibilidad al carcinoma colorrectal (CCR) se han identificado inicialmente en poblaciones europeas, utilizando técnicas como las de estudios amplios de asociación del genoma (GWAS) y el mapeo fino por ligamiento. Estos marcadores, no necesariamente tienen un impacto en el fenotipo; pueden estar señalando un gen candidato, verdadera causal de la asociación. En este trabajo, se analizan, en relación con el riesgo a CCR, las regiones cromosómicas comprometidas y el rol del mestizaje; para lo cual se integran datos genéticos, análisis estadísticos y ensayos bioinformáticos de 20 regiones cromosómicas, en los 955 casos y 968 controles provenientes del proyecto «Genetic Study of Common Bowel Cancer in Hispania and the Americas –CHIBCHA-», en la Región Andina Colombiana. Se utilizaron dos paneles de Affymetrix, para tipificar 1.169.944 SNPs y evaluarlos, teniendo en cuenta el desequilibrio de ligamiento, las historias demográficas, el mestizaje, la estructura genética, la ancestría local y patrones de interacciones SNP-SNP. Cinco regiones se asociaciaron significativamente al riesgo (18q21.1, 19q13.11, 10p14, 14q22.2, 8q23.3); por mapeo fino se descartó la 14q22.2, pero se anexaron otras dos (20p21.3 y 8q24.21) que presentaron picos significativos; en marcadores no reportados, con una estructura haplotípica particular. El componente ancestral europeo, se asoció con el riesgo; a nivel cromosómico local, se detectaron las regiones 6q23.2 y 4p13; se evidenció el efecto del mestizaje con nuevas relaciones alélicas y se observaron bloques genéticos distintos a los de las poblaciones europeas. Las regiones asociadas revelan un transfondo molecular común del desarrollo y patogénesis del CCR en humanos, vías de señalización celular previamente identificadas en europeos y asiáticos, importantes para la homeóstasis del crecimiento, la diferenciación y la migración celular. Los resultados, que amplìan el conocimiento de la patogénesis molecular y su potencial aplicación en el campo del diagnóstico y tratamiento, están siendo sometidos a validación con otras cohortes. Palabras clave: Cáncer, colorrecto, Colombia, Mezcla genética, riesgo, SNPs
- PublicaciónRestringidoEstudio genético del carcinoma colorrectal esporádico y familiar en Colombia(Ibagué : Universidad del Tolima, 2016, 2016) Bohórquez Lozano, Mabel ElenaIntroducción En este trabajo, se planteó describir las principales características clínicopatologicas y algunos de los fenotipos moleculares de Carcinoma Colorrectal (CCR), enfermedad que presenta altas tasas de incidencia y mortalidad en Colombia. Métodos Se analizaron dos grupos en una muestra de 1278 pacientes a saber: 1) CCR esporádico y 2) CCR con agregación familiar. En el primer grupo, se evaluaron por PCR convencional los genes APC, KRAS y TP53 y, utilizando “Next generation sequencing” (NGS), además de los anteriores, se estudiaron otros 47 genes involucrados con la predisposición a desarrollar cáncer. En el segundo grupo, se analizaron variantes de los genes MMR, MUTYH y APC y otros genes involucrados en síndromes hereditarios como: STK11, PTEN, POLE, SMAD4 y CDH1. Para los análisis de expresión de los genes MMR (Mismatch Repair) hMLH1, se utilizaron métodos inmunohistoquímicos (IHC), usando ADN de tejido tumoral incluido en parafina, para buscar mutaciones somáticas por PCR convencional y NGS con la metodología Ion Torrent. En los casos de CCR con agregación familiar, se aplicaron criterios clínicos, se tomo una muestra de sangre por venopunción periférica, a partir del ADN se crearon librerias genicas, mediante PCR microfluídica de fluidigm y, posteriormente, se secuenciació por Illumina Miseq, las variantes candidatas resultantes se secuenciaron por (sanger); el análisis de inestabilidad microsatelital se realizó por PCR-FCE (fluorescent capillary electrophoresis) usando el panel de Bethesda.Resultados Los resultados muestran que el promedio de edad de los pacientes colombianos con CCR es de 57,4 años, aproximadamente 10 años menor que en los países desarrollados; la enfermedad es más frecuente en el género femenino 53,2%. La frecuencia de los pacientes menores de 50 años (26,5%), es mayor a la esperada, el CCR, en estos casos se asoció a los tipos histológicos agresivos -carcinoma mucinoso y carcinoma en anillo de sello- p=<0.000, los cuales, a su vez, resultaron asociados a inestabilidad microsatelital (MSI-H). La localización más frecuente fue en el recto (31,1%), p=0,002 y el diagnóstico se produjo en estados avanzados de la enfermedad T3-T4 (75,1%) p=0,022. El tipo histológico más frecuente es el adenocarcinoma. La sensibilidad del análisis inmunohistoquímico de MLH1 para la detección de MSI+, fue de 71% (CI: 49 - 87). El análisis por IHC-MLH1 en 575 casos mostró pérdida de la expresión en el 7% de los pacientes. Las pruebas de MSI (inestabilidad microsatelital) se realizaron en 451 casos de CCR; el 23% presentaron alta inestabilidad microsatelital (MSI-H). El panel molecular para genes conocidos, relacionados con CCR esporádico, que esperamos se convierta en una herramienta para el desarrollo de nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas, revela hasta el momento -además de algunas variantes nuevas con potencial patogénico, en fase de validación-, los siguientes porcentajes de mutaciones: KRAS 23,9%, TP53 63,4% y APC 40,3%. Las variantes más frecuentemente encontradas por tipo de gen son: TP53 R175H (26%), KRAS G12D (11%), APC K1363N (14%); el 25% de los pacientes son triple negativos para las mutaciones en estos genes lo que obliga a investigar otras rutas en la carcinogénesis del CCR. El 66% de las mutaciones encontradas por el método NGS resultaron ser no sinónimas, el gen con mayor frecuencia de mutaciones patogénicas por NGS fue el APC (12%).En el grupo de personas con síndromes de CCR con agregación familiar, se muestrearon 459 pacientes, 74% de ellos fenotípicamente sanas, 72% menores de 50 años; se identificaron 48 mutaciones en genes conocidos, de las cuales 18 tienen implicaciones funcionales. El síndrome familiar más frecuente es el de Lynch 85%, con tres mutaciones no sinónimas en MSH2, de las cuales dos se presentaron en más de una familia -MSH2 c.G1034A y MSH2 c.1552C>T, en dos y tres individuos respectivamente, estas variantes fueron reportadas previamente en Europa, pero no se encontraron reportes para Colombia- la tercera es una variante nueva -c.2458+1G>T con potencial patogénico, en evaluación-. Para MLH1, se encontraron la mutación c.C445T, sin reportes conocidos en Colombia y, una variante nueva c.545+1G>C con potencial patogénico, en evaluación. Adicionalmente, en este trabajo se presentan los primeros reportes para Colombia de poliposis asociada a las variantes SMAD4 c.403C>T y MUTYH c.1437_1439delGGA. El 80% del total de las familias corresponde a casos de CCR familiar no sindrómico, generalmente clasificados como like Linch y poliposicos, en los que no se encontraron mutaciones en genes conocidos de alto riesgo para síndromes familiares, por lo tanto, se genera la necesidad de implementar nuevas dianas moleculares para determinar un perfil genético de esos pacientes, que permita establecer el riesgo de padecer la enfermedad. Conclusiones El CCR en Colombia se presenta en promedio 10 años antes comparado con los países desarrollados. Es necesario establecer políticas públicas de tamizaje para CCR en la población menor de 50 años, realizar el tamizaje con Inmunohistoquimica para MLH1 y la determinación de inestabilidad microsatelital, que permiten identificar pacientes en riesgo de ser portadores de mutaciones relacionadas con síndrome de Lynch. La identificación de variantes génicas nuevas y de las mutaciones con primer reporte para Colombia, en genes relacionados con cáncer familiar, permitirá, establecer estrategias preventivas para el tamizaje de dichas mutaciones en la población en riesgo.