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Obtención y caracterización molecular de clones de trypanosoma cruzi seleccionados mediante plaqueo directo en medio sólido del contenido de la ampolla rectal de rhodnius colombiensis, r. pallescens y r. prolixus procedentes de diferentes regiones de Colombia

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dc.contributor.authorVilla Villamil, Lina Marcelaspa
dc.contributor.colaboratorVallejo, Gustavo Adolfo (Director)spa
dc.date.accessioned2015-05-20T21:07:52Z
dc.date.available2015-05-20T21:07:52Z
dc.date.issued2011
dc.description148 Páginasspa
dc.description.abstractMediante este estudio fue posible obtener y aislar clones de Trypanosoma cruzi a partir del contenido de la ampolla rectal de vectores silvestres (Rhodnius colombiensis, R. prolixus y R. pallescens) utilizando el método de plaqueo en medio sólido. El rango óptimo para obtener clones fue entre 700-800 parásitos/100μl, observando colonias entre 30-35 días pos-plaqueo. La eficacia de plaqueos positivos fue superior para los vectores Rhodnius colombiensis y R. pallescens, presentando mayores infecciones reflejadas en un aumento del número de clones, siendo opuesto a lo observado para R. prolixus, esto posiblemente debido a la presencia de diferentes microorganismos, los cuales pueden favorecer o inhibir el crecimiento del parásito. La técnica de plaqueo permitió obtener una misma línea genética (clon), comprobado por reclonación y caracterización molecular por PCR específico y RAPD’s, mostrando idéntico perfil entre los clones obtenidos a partir del clon parental y el clon parental. Se observó, que un clon silvestre puede presentar un solo haplotipo (TcIa o TcIb o TcId) o diferentes haplotipos (TcIa/TcIb, TcIa/TcId, TcIb/TcId o TcIa/TcIb/TcId), para explicar esto se plantearon dos hipótesis: 1. Posiblemente la eficiencia de los iniciadores está siendo afectada por un problema de anillamiento, razón por la cual, se realizó la modificación del iniciador 1A (1Am) permitiendo la identificación específica para el haplotipo TcIa, en cepas de origen humano como de origen silvestre. Las cepas de humanos presentaron el perfil de TcIa y las silvestres no lo mostraron, indicando que si se halla este haplotipo (TcIa) es de origen doméstico y la ausencia de este perfil es origen silvestre, definiéndose ciertamente para Colombia dos grandes grupos, uno de origen doméstico y otro de origen silvestre. Esto fue soportado por el análisis de RAPDs donde las cepas aisladas de humanos (TcIa), se agruparon independiente a los clones de los vectores silvestres, indicando diferencias en su genoma respecto a los clones, confirmando la posible existencia de los dos grupos. 2. Pueden existir copias múltiples en tandem de secuencias repetidas y variables de SL-IR del gen miniexon, que privilegian en un momento dado un haplotipo más que a otro, indicando que en un solo clon puede presentar variabilidad entre las copias de la SL-IR, implicando la posible ocurrencia de por lo menos dos diferentes haplotipos, teniendo en cuenta que sería uno en cada cromosoma homólogo ya que T. cruzi es considerado un organismo diploide. Esta variabilidad es soportada con la amplificación de TcIe reportado como exclusivo de países del cono sur de Suramérica. Se recomienda el empleo de otros marcadores moleculares que puedan mostrar la asociación de los ciclos doméstico y silvestre en nuestro país.spa
dc.description.abstractABSTRACT Through this study it was possible to obtain and isolate clones of Trypanosoma cruzi from the contents of the rectal ampulla of wildlife vectors (Rhodnius colombiensis, R. prolixus and R. pallescens) using plating on solid medium. The optimum range for clones was between 700-800 parásitos/100μl observing colonies between 30-35 days post-plating. The plating efficiency was higher for positive vectors Rhodnius colombiensis and R. pallescens, showed higher infection reflected in an increasing number of clones, being opposite to that observed for R. prolixus, this may due to the presence of different microorganisms, which may promote or inhibit the growth of the parasite. Plating technique yielded the same genetic line (clone) recloning tested by molecular characterization of specific PCR and RAPD's, showing the same profile among clones obtained from the parental clone and the parental clone. It was observed that a wild clone may have a single haplotype (or TcIb TcIa or TcId) or different haplotypes (TcIa / TcIb, TcIa / TcId, TcIb / or TcIa TCID / TcIb / TcId) to explain this proposed two hypotheses: 1. Perhaps the efficiency of the initiators is being affected by a problem with alignment, reason why, it made the change initiator 1A (1Am) allowing the specific identification of the haplotype TcIa in strains of human origin as from the wild. The human strains showed the profile of TcIa and wild did not show it, indicating that if this haplotype is (TcIa) is of domestic origin and the absence of this profile is wild, define certain to Colombia two groups, one of domestic origin and one from the wild. This was supported by the analysis of RAPDs where human strains (TcIa) were grouped independent clones of wild vectors, indicating differences in their genome compared to clones, confirming the possible existence of two groups. 2. There may be multiple copies in tandem repeated sequences and variable SL-IR gene miniexon that privilege at any given time one haplotype over another, indicating that a single clone may have variability between copies of the SL-IR, implying the possible occurrence of at least two different haplotypes, taking into account that would be one on each homologous chromosome as T. cruzi is considered a diploid organism. This variability is supported with the amplification of TcIe reported as exclusive Southern Cone of South America. We recommend the use of other molecular markers that can show the association of domestic and wild cycles in our country.spa
dc.description.tableofcontentsINTRODUCCIÓN 21 1. JUSTIFICACIÓN 23 2. OBJETIVOS 24 2.1 OBJETIVO GENERAL 24 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 24 3. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA 25 4. MARCO REFERENCIAL 29 4.1 ASPECTOS RELEVANTES DE LA FAMILIA TRYPANOSOMATIDAE 29 4.1.1 Estructuras celulares de Tripanosomas 29 4.2 CICLO DE VIDA DE Trypanosoma cruzi 30 4.3 TRANSMISIÓN DE Trypanosoma cruzi 31 4.4 ENFERMEDAD DE CHAGAS 32 4.4.1 Manifestación clínica 30 4.4.2 Tratamiento 34 4.5 EPIDEMIOLOGÍA 34 4.6 ESTRUCTURA MULTICLONAL DE LA POBLACIÓN 35 4.7 DIVERSIDAD GENÉTICA DE Trypanosoma cruzi 37 4.7.1 Gen mini –exón 40 4.8 VECTORES TRIATOMINOS 42 4.8.1 Clasificación sistemática de la subfamilia Triatominae 43 4.8.2 Evolución de los triatominos 43 4.8.3 4.8.4 4.8.5 4.9 Rhodnius prolixus Rhodnius colombiensis Rhodnius pallescens CLONACIÓN EN MEDIO SÓLIDO DE Trypanosoma cruzi 46 48 48 50 5. MATERIALES Y MÉTODOS 52 5.1 COLECTA DE MATERIAL DE CAMPO 52 5.2 PROCESAMIENTO DEL MATERIAL BIOLÓGICO 52 10 5.2.1 Preparación de la placa con medio sólido Pág. 52 5.2.2 Trypanosoma cruzi aislado de vectores del género Rhodnius 52 5.2.3 5.2.4 Plaqueo de parásitos en cajas de medio sólido Aislamiento de colonias 53 53 5.3 5.3.1 5.3.2 DIGESTIÓN Y EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS DE LOS CLONES Digestión de Parásitos Extracción de ácidos nucléicos 53 53 53 5.3.3 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 Cuantificación del DNA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS CLONES PCR específico PCR aleatorio Electroforesis y condiciones de corrido Analisis de los perfiles de RAPD’s Análisis estadístico 54 54 54 62 63 64 64 6. RESULTADOS 66 6.1 6.2 6.2.1 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.3.6 7. COLECTA DE MATERIAL DE CAMPO PROCESAMIENTO DEL MATERIAL BIOLÓGICO. Preparación de placas, aislamiento del parásito y plaqueo CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS CLONES OBTENIDOS POR PLAQUEO EN MEDIO SÓLIDO Determinación del linaje de Trypanosoma cruzi Identificación de los haplotipos para Trypanosoma cruzi I Identificación de los haplotipos de Trypanosoma cruzi I en cepas de origen doméstico Modificación del Primer 1A para la identificación del haplotipo TcIa Ensayo preliminar para identificación del Genotipo TcIe Análisis de RAPD´s DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES 66 67 67 69 70 74 80 82 87 88 93 101 103 11 REFERENCIAS ANEXOS Pag. 104 115spa
dc.format.mimetypeapplication/pdfspa
dc.identifier.citationVilla Villamil, Lina Marcela. Obtención y caracterización molecular de clones de trypanosoma cruzi seleccionados mediante plaqueo directo en medio sólido del contenido de la ampolla rectal de rhodnius colombiensis, r. pallescens y r. prolixus procedentes de diferentes regiones de Colombia. Ibagué: Universidad del Tolima, 2011. <http://repository.ut.edu.co/handle/001/1404>spa
dc.identifier.localPendiente
dc.identifier.otherPendiente
dc.identifier.urihttps://repository.ut.edu.co/handle/001/1404
dc.language.isospaspa
dc.publisherIbagué: Universidad del Tolima, 2011.spa
dc.publisher.providerCountry170 COL COspa
dc.rightsAtribución-NoComercial-CompartirIgual 2.5 Colombia (CC BY-NC-SA 2.5 CO)spa
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessspa
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/co/spa
dc.subjectPlaqueo en medio sólidospa
dc.subjectvectores silvestresspa
dc.subjectClonesspa
dc.subjectIniciador 1A modificadospa
dc.subjectHaplotipos de Trypanosoma cruzi Ispa
dc.thesis.disciplineFacultad De Ciencias, Maestría En Ciencias Biológicasspa
dc.thesis.grantorVallejo, Gustavo Adolfo (Director)spa
dc.thesis.levelMaestríaspa
dc.thesis.nameMagíster en Ciencias Biológicasspa
dc.titleObtención y caracterización molecular de clones de trypanosoma cruzi seleccionados mediante plaqueo directo en medio sólido del contenido de la ampolla rectal de rhodnius colombiensis, r. pallescens y r. prolixus procedentes de diferentes regiones de Colombiaspa
dc.typeTrabajo de grado - Maestríaspa
dc.type.dcmi-type-vocabularyTextspa
dc.type.driverinfo:eu-repo/semantics/masterThesisspa
dc.type.versioninfo:eu-repo/semantics/updatedVersionspa
dspace.entity.typePublication
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