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Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex

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dc.contributor.authorSpeck Hernández, Cesar Augustospa
dc.date.accessioned2014-08-20T21:01:04Z
dc.date.available2014-08-20T21:01:04Z
dc.date.issued2013
dc.description87 Páginas. Recurso Electrónicospa
dc.description.tableofcontentsINTRODUCCIÓN 16 1. MARCO TEORICO Y REVISIÓN DE LA LITERATURA 18 1.1 LOS TELÓMEROS 18 1.1.1 Estructura de los telómeros 19 1.1.2 Replicación de los telómeros 22 1.2 LONGITUD TELOMÉRICA 23 1.2.1 Métodos para la medición de la longitud telomérica 25 1.2.1.1 Flow-Fish 25 1.2.1.2 Southern blot de análisis de fragmentos de restricción 26 1.2.1.3 PCR en tiempo real cuantitativa 26 1.2.1.4 Análisis de longitud telomérica simple (STELA) 30 1.2.1.5 Medición de longitud telomérica en células sencillas 31 1.2.1.6 Dot Blot 31 1.3 LONGITUD TELOMÉRICA Y GÉNERO 31 1.4 LONGITUD TELOMÉRICA, EDAD Y ENVEJECIMIENTO 32 1.5 LONGITUD TELOMÉRICA Y APOLIPROTEÍNA E (APOE) 1.6 LONGITUD TELOMÉRICA Y TRANSPORTADOR DE SEROTONINA (SLC6A4) 35 2. OBJETIVOS 36 2.1 OBJETIVO GENERAL 36 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 36 3. METODOLOGÍA 37 3.1 LABORATORIO DE INVESTIGACIÓN DONDE SE REALIZO EL ESTUDIO 37 3.2 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN 37 3.3 POBLACIÓN DE ESTUDIO 37 3.4 EXTRACCIÓN DE ADN 38 3.5 CUANTIFICACIÓN DE ADN 38 3.6 NORMALIZACIÓN DE LAS MUESTRAS 38 3.7 OPTIMIZACIÓN DE LA PRUEBA 38 3.7.1 Ensayo 1 38 3.7.2 Ensayo 2 39 3.7.3 Ensayo 3 39 3.7.4 Ensayo 4 39 3.7.5 Ensayo 5 39 3.7.6 Ensayo 6 39 3.7.7 Ensayo 7 39 3.7.8 Ensayo 8 39 3.7.9 Muestras 39 3.7.10 Programa de amplificación 39 3.7.11 Verificación de productos de amplificación 39 3.8 CUANTIFICACIÓN DE LA LONGITUD TELOMÉRICA RELATIVA 40 3.8.1 Reactivos 40 3.8.1.1 Master Mix 40 3.8.1.2 Sonda Fluorescente 40 3.8.1.3 Primers 40 3.8.2 Programa de amplificación 40 3.8.3 Preparación de la prueba 41 3.8.4 Equipo 42 3.8.5 Análisis de resultados 42 3.8.5.1 Curva de Melting 42 3.8.5.2 Eficiencia de la PCR 42 3.8.5.3. Curva de calibración 42 3.8.5.4. Calculo de la proporción T/S 42 3.8.6 Análisis estadísticos 43 4. RESULTADOS 44 4 .1 OPTIMIZACIÓN DE LA PRUEBA 44 4.2 CUANTIFICACIÓN DE LA LONGITUD TELOMÉRICA 52 4.2.1 Descripción de la población 52 4.2.2 Longitud Telomérica 52 4.2.3 Longitud telomérica y edad 53 5. DISCUSIÓN 54 6. CONCLUSIONES 65 7. RECOMENDACIONES 67 REFERENCIAS 68 ANEXOS 83 RESUMEN. Los telómeros son estructuras de DNA que protegen el final de los cromosomas de su degradación y fusión. Son así mismo esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica. Los estudios demuestran el rol de los telómeros en envejecimiento celular. Puesto que la maquinaria de replicación no puede replicar completamente el final de los cromosomas, los telómeros se acortan progresivamente con cada división celular, activando eventualmente la senescencia celular. La longitud telomérica (LT) sin lugar a dudas es un marcador importante de las capacidades proliferativas de las células. Muchos estudios han relacionado a la LT con enfermedades como el cáncer, enfermedades coronarias, neurológicas, predisposición a infecciones o el proceso de envejecimiento. La LT puede depender de muchas variables: edad, género, ancestría. No obstante no se tiene claridad de cómo o en qué medida estas variables puedan afectar la longitud de los telómeros de un individuo en particular. Los estudios relacionando todas estas variables son muy escasos, sobre todo para Latinoamérica. El objetivo de nuestro trabajo es determinar con exactitud la longitud de los telómeros de 98 individuos sanos de un promedio de edad de 20.86 años y de un rango de edad 18 a 28 años. El 75.5 % son mujeres. Se incluyeron los individuos basándonos en su genotipo APOE, de los cuales el 21,4 % son portadores del alelo de riesgo ε4 (ε3/ε4) y el 77 % son individuos no portadores (ε3/ε3). Para el gen SLC6A4 se seleccionaron aquellos que fueran homocigotos para la variante L (32,6 %) y heterocigotos L/S (62,2 %). Para la cuantificación de la LT se utilizó un PCR en tiempo real multiplex con la que se amplificó en una misma reacción tanto la región telomérica, como el gen de referencia de copia única albumina. Posterior a una optimización de la prueba donde se seleccionó como Master Mix la HRM sensimix (Bioline), se calculó el ΔΔCt de la reacción a partir del uso de ADN de una línea celular estándar U937 de longitud telomérica conocida (6.3 kb). La LT promedio de la muestra estudiada fue 5,187 Kb. No se encontró ninguna diferencia significativa entre los grupos estudiados (Hombres vs. Mujeres [P>0.05]), (APOE ε3/ε4 vs. APOE ε3/ε3 [P>0.05]), (SLC6A4 L/L vs. SLC6A4 13 L/S [P>0.05). Tampoco se encontró correlación entre la LT y la edad. Este es el primer estudio en Colombia y Latinoamérica que analiza la longitud telomérica en población sana usando PCR en tiempo real multiplex. Palabras claves: Telómeros, Longitud Telomérica, PCR en tiempo Real, Edad, Genero, APOE, SLC6A4. ABSTRACT. The telomeres are DNA structures that protect the chromosome ends from degradation and fusion. Furthermore, they are essential for the maintenance of genomic integrity. Experimental approaches have demonstrated the role of telomeres in cellular aging. Given that the replication complex is unable to replicate completely the chromosome ends, the telomeres shorten progressively with each cellular division. The telomere length (TL) is an important marker of cellular replicative capacities. Several studies have related the telomere length with the risk for diseases such as cancer, cardiovascular or neurological diseases, and infection predisposition or with normal aging. Telomere length can depend on many variables: age, gender, ancestry, rate of cell replication, among others. Nevertheless, it is not clear the real implications of these variables in the telomere length. Studies focused on the relationship of telomere length with these variables are limited in Latinoamérica. The aim of this study was to determine with accuracy the telomere length in 98 healthy young individuals, with a mean age of 20.86 years (range from 18 to 28 years, 75.5 % were women). The individuals were included based on their APOE genotype, 22% were APOE ε4 carriers (ε3/ε4) and 77 % were non-carriers individuals. For SLC6A4 genotype, 32.6 % individuals homozygous for the variant L and 62.2 % L/S heterozygous were selected. For measurement of the telomere length, it was used a Multiplex Real Time PCR, with this technique it was possible to amplify in the same reaction the telomere region as well as the single copy gene (albumin). After an optimization process, it was selected the Master Mix HRM sensimix (Bioline) and it was calculated the ΔΔCt, using as standard DNA from the cell line U937 (known telomere length of 6.3 kb). The mean TL in the samples studied was 5.187 kb. No significant differences were found between the groups studied (Men vs. Women [P>0.05]), (APOE ε3/ε4 vs. APOE ε3/ε3 [P>0.05]), (SLC6A4 L/L vs. SLC6A4 L/S [P>0.05). In addition, no statistically significant correlation was found between TL and age. This is the first study in Colombia and Latin America that analyze telomere length in a healthy population, using multiplex real-time PCR. Keywords: Telomeres, Telomere Length, Real Time PCR, Age, Gender, APOE, SLC6A4.spa
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dc.identifier.citationSpeck Hernández, Cesar Augusto. Cuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplex. Ibagué : Universidad del Tolima,2013. <http://repository.ut.edu.co/handle/001/1085>spa
dc.identifier.localT 0701 239 CD3384
dc.identifier.otherCD3384
dc.identifier.urihttps://repository.ut.edu.co/handle/001/1085
dc.language.isospaspa
dc.publisherIbague : Universidad del Tolima, 2013.spa
dc.rightsAtribución-NoComercial-CompartirIgual 2.5 Colombia (CCBY-NC-SA 2.5 CO)spa
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessspa
dc.rights.urihttp://www.creativecommons.org/licenses by-nc/2.5/co/spa
dc.subjectTelómerosspa
dc.subjectLongitud Teloméricaspa
dc.subjectPCR en tiempo realspa
dc.subjectEdadspa
dc.subjectGénerospa
dc.subjectAPOEspa
dc.subjectSLC6A4spa
dc.subjectTelomeresspa
dc.subjectTelomere Lengtheng
dc.subjectReal Time PCReng
dc.subjectAgeeng
dc.subjectGendereng
dc.subjectAPOEeng
dc.subjectSLC6A4eng
dc.thesis.disciplineFacultad de Ciencias, Programa de Biologíaspa
dc.thesis.grantorForero, Diego A. (Director)spa
dc.thesis.levelPregradospa
dc.thesis.nameBiólogospa
dc.titleCuantificación relativa de longitud telomérica en una muestra de individuos jóvenes colombianos a través de una técnica de pcr en tiempo real multiplexspa
dc.typeTrabajo de grado - Pregradospa
dc.type.dcmi-type-vocabularyTextspa
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dc.type.versioninfo:eu-repo/semantics/publishedVersionspa
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