Factores líticos innatos de los vectores del grupo Prolixus contra genotipos de Trypanosoma rangeli y DTUs de Trypanosoma cruzi
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Hasta la fecha se han descrito cinco genotipos de Trypanosoma rangeli denominados A, B, C, D y E. Por otro lado, se han sido descrito 21 especies del género Rhodnius, consideradas como los vectores biológicos de este parásito. Las especies de Rhodnius conforman tres grupos filogenéticos, el grupo Pallescens al occidente de la cordillera de los Andes y los grupos Pictipes y Prolixus al oriente de esta cordillera. Algunos genotipos de T. rangeli, no logran sobrevivir a la respuesta inmune de algunas especies de Rhodnius y no consiguen producir formas infectivas en las glándulas salivares. Cuando T. rangeli ingresa al intestino del vector, debe enfrentar diversas enzimas digestivas, hemolisinas, aglutininas, factores derivados de la microbiota intestinal, péptidos antimicrobianos y factores líticos. Posteriormente, cuando el parásito atraviesa la pared intestinal del vector, se enfrenta en la hemolinfa con péptidos animicrobianos, activación del sistema profenol oxidasa, fagocitosis, producción de superóxido y óxido nítrico. En este trabajo se examinó la inmunidad innata en el contenido intestinal y la hemolinfa de siete especies de vectores contra los cinco genotipos de T. rangeli, encontrando que en el intestino anterior y en la hemolinfa de dos especies del grupo Prolixus (R. prolixus, R. robustus) se detectaron factores líticos innatos, de naturaleza proteica, contra T. rangeli C y T. rangeli E. La inoculación de los genotipos C y E en el hemocele de R. prolixus también mostró lisis de los parásitos. Los genotipos A, B y D de T. rangeli presentaron resistencia a la lisis. En las especies del grupo Pallescens (R. pallescens, R. colombiens y R. ecuadoriensis), en R. pictipes, Triatoma maculata y Panstrongylus geniculatus no se detectaron factores líticos en los mismos tejidos de los insectos contra ningún genotipo de T. rangeli. En Trypanosoma cruzi se han reportado seis unidades taxonómicas discretas (DTUs), denominadas T. cruzi I, II, III, IV, V y VI; adicionalmente se han descrito T. cruzi bat y T. cruzi marinkellei. La caracterización molecular de las cepas de T. cruzi aisladas de cinco géneros de triatominos vectores, muestra que en algunas regiones geográficas de Latinoamérica existe predominio de algunas DTUs del parásito sobre otras, indicando que el vector podría ser responsable de esta distribución geográfica variable de las DTUs. Cuando T. cruzi ingresa al intestino del vector, debe enfrentar diversas enzimas digestivas, hemolisinas, aglutininas, factores derivados de la microbiota intestinal, péptidos antimicrobianos, activación del sistema profenol oxidasa, producción de superóxido, y producción de óxido nítrico. En este trabajo, se detectaron factores líticos innatos en el intestino anterior de R. prolixus y R. robustus contra T. cruzi II y en la hemolinfa de los mismos vectores, se detectó actividad lítica contra T. cruzi II, III, V, VI, T. cruzi bat y T. cruzi marinkellei. Adicionalmente fue posible comprobar que estos factores innatos, de naturaleza proteica, contra T. rangeli o contra T. cruzi, son independientes de la fuente de alimento (mamífero o ave) e independientes de los factores del complemento de las aves o de los mamíferos. También se comprobó que la actividad lítica fue independiente del tiempo de mantenimiento de los parásitos en medios de cultivo y que los resultados fueron idénticos con vectores recién capturados en el campo y con aquellos mantenidos en colonias de laboratorio durante varios años. En ninguna de las restantes especies estudiadas, R. pallescens, R. colombiensis, R. ecuadoriensis, R. pictipes, T. maculata y P. geniculatus, se detectaron factores líticos contra las diferentes DTUs de T. cruzi. En el contenido del intestino anterior y en la hemolinfa de R. prolixus (especie con actividad tripanolítica), se identificaron 28 y 103 proteínas respectivamente, mediante análisis de espectrometría de masas en tándem acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (LC-MS/MS). En el contenido del intestino anterior y en la hemolinfa de R. colombiensis (especie sin actividad tripanolítica) se identificaron 17 y 85 proteínas respectivamente. De las proteínas identificadas, 43 se relacionaron con respuesta inmune, tales como reconocimiento de carbohidratos y lípidos, activación y regulación de cascadas proteolíticas, proteínas relacionadas con estrés oxidativo, péptidos antimicrobianos y proteínas relacionadas con el sistema del complemento. El análisis de presencia/ausencia de estas proteínas en las dos especies de vectores, mostró que en el intestino anterior de R. prolixus, se detectaron las nitroforinas 1, 2, 4A y en la hemolinfa las nitroforinas 1, 4, 4A, los péptidos antimicrobianos defensina y prolixina. Estas proteínas no fueron detectadas en el intestino anterior y en la hemolinfa de R. colombiensis. Debido a que las nitroforinas son moléculas transportadoras de óxido nítrico, su presencia en la saliva que ingresa al intestino anterior durante la toma del alimento, podría ser responsable de la liberación del óxido nítrico, el cual es tóxico para el parásito y podría responder por la lisis observada. En la hemolinfa, las nitroforinas detectadas, la defensina y la prolixina, podrían estar asocadas con la actividad lítica encontrada. Nuevos estudios sobre estas moléculas permitirán reconocer sus mecanismos de acción sobre T. rangeli y T. cruzi. El hallazgo inédito de las nitroforinas como factores antiparasitarios, y probablemente de algunos péptidos antimicrobianos, se reporta por primera vez en el intestino anterior y en la hemolinfa de R. prolixus, representante del grupo Prolixus, pero ausente en R. colombiensis, representante del grupo Pallescens. Estos hallazgos soportan la hipótesis propuesta en este trabajo, sobre el papel de las especies del grupo Prolixus, en las cuales estos factores antiparasitarios de inmunidad innata, estarían sobreexpresados y podrían responder por la escasa o nula circulación de T. cruzi II, V, VI, T. cruzi bat, T. cruzi marinkellei, T. rangeli C y E en los vectores del grupo Prolixus en algunas regiones de Latinoamérica. Nuevos trabajos con otras especies de vectores de los grupos Prolixus y Pictipes, permitirán obtener información para fortalecer la hipótesis aquí propuesta. Palabras clave: Trypanosoma cruzi, T. rangeli, transmisión selectiva, grupo Prolixus, enfermedad de Chagas, Rhodnius prolixus, R. robustus, intestino anterior, hemolinfa, nitroforinas, péptidos antimicrobiales
Resumen en español
Five Trypanosoma rangeli genotypes have been described to date, denominated A, B, C, D and E; complementarily, 21 species from the genus Rhodnius have been described, these being considered this parasite’s biological vectors. Rhodnius species form three phylogenetic groups: the Pallescens group to the west of the Andes mountain range and the Pictipes and Prolixus groups to the east of this mountain range. Some T. rangeli genotypes do not survive the immune response of some Rhodnius species and fail to produce infective forms in the salivary glands. When T. rangeli enters a vector’s intestine it has to deal with various digestive enzymes, haemolysins, agglutinins, intestinal microbiota-derived factors, antimicrobial peptides (AMPs) and lytic factors. Then, when it crosses the vector’s intestinal wall it has face AMPs, the prophenoloxidase-activating system, phagocytosis, superoxide and nitric oxide production of in the haemolymph. This work has examined innate immunity against the five T. rangeli genotypes regarding the intestinal content and haemolymph of seven vector species; protein-related innate lytic factors were detected against T. rangeli C and T. rangeli E in the intestine and haemolymph of two species from the Prolixus group (R. prolixus, R. robustus). Inoculating C and E genotypes into R. prolixus haemocoel also revealed parasite lysis; T. rangeli genotypes A, B and D were resistant to lysis. R. pictipes, Triatoma maculata and Panstrongylus geniculatus the Pallescens group species (i.e. R. pallescens, R. colombiensis and R. ecuadoriensis), did not show lytic factors against any T. rangeli genotype in the same insect tissues. Six discrete taxonomic units (DTU) have been reported in Trypanosoma cruzi, called T. cruzi I, II, III, IV, V and VI; T. cruzi bat and T. cruzi marinkellei have also been described. The molecular characterisation of T. cruzi strains isolated from five genera of triatomine vectors has shown predominance of several parasite’s DTUs over others in some geographical regions of Latin America, indicating that the vector could be responsible for such variable DTU geographical distribution. When T. cruzi enters a vector’s intestine it must face various digestive enzymes, haemolysins, agglutinins, intestinal microbiota-derived factors, AMPs, prophenoloxidase activating system, superoxide production and nitric oxide production. Innate lytic factors were detected in this work in of R. prolixus and R. robustus anterior intestine against T. cruzi II and lytic activity was detected against T. cruzi II, III, V, VI, T cruzi bat and T. cruzi marinkellei in the same vectors’ haemolymph. It was found that these protean-related innate factors against T. rangeli or against T. cruzi were independent of food source (mice or chickens) and independent of chickens or mice’ complement factors. It was also found that lytic activity occurred regardless of parasite maintenance time in culture media and that results were identical for vectors recently captured in the field compared to those kept in laboratory colonies for several years. No lytic factors were detected against T. cruzi DTUs in any of the remaining species studied, i.e. R. pallescens, R. colombiensis, R. ecuadoriensis, R. pictipes, T. maculata and P. geniculatus. Twenty-eight proteins were identified in R. prolixus anterior intestine contents and 103 in haemolymph (R. prolixus is a species having trypanolytic activity) by tandem mass spectrometry analysis coupled to high-performance liquid chromatography (LC-MS/MS); 17 proteins were identified in R. colombiensis anterior intestine content and 85 in the haemolymph (R. colombiensis is a species lacking trypanolytic activity). This work thus constitutes the first report of proteomic analysis of R. prolixus and R. colombiensis haemolymph. Forty-three of the proteins identified were related to immune responses, such as carbohydrate recognition, proteolytic cascade activation and regulation, oxidative stress-related proteins, AMPs and complement system-related proteins. Analysis regarding the presence/absence of these proteins in the two species of vector revealed nitrophorins 1, 2, 4A in R. prolixus intestine and nitrophorins 1, 4, 4A and AMPs defensin, prolixin and trypsin-like serine protease were detected in its haemolymph. These proteins were not detected in R. colombiensis intestine and/or haemolymph. Because nitrophorins are nitric oxide transport molecules, their presence in saliva entering the anterior intestine during food intake may trigger nitric oxide release, this being toxic for the parasite and could have been responsible for the observed lysis. The nitrophorins detected in haemolymph and defensin, prolixin and trypsin-like serine protease, could have been related to the observed lysis. Further studies regarding these molecules should enable recognising their T. rangeli and T. cruzi-related mechanisms of action. The as-yet unpublished finding of nitrophorins as antiparasitic factors, and probably of some AMPs, is reported for the first time as being present in R. prolixus anterior intestine and haemolymph (representative of the Prolixus group) but absent in R. colombiensis (representative of the Pallescens group). These findings support the hypothesis proposed in this work regarding the role of Prolixus group species; these innate immunity-related antiparasitic factors might be overexpressed and could respond to the little or no circulation of T. cruzi II, V, VI , T. cruzi bat, T. cruzi marinkellei, T. rangeli C and E in Prolixus group vectors in some regions of Latin America. Further work with other vector species from the Prolixus and Pictipes groups will enable information to be obtained for strengthening the hypothesis proposed here. Keywords: Trypanosoma cruzi, T. rangeli, selective transmission, Prolixus group, Chagas’ disease, Rhodnius prolixus, R. robustus, anterior midgut, hemolymph nitrophorin, antimicrobial peptides
